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OVMANA細胞

二、細胞(bao)培養(yang)操(cao)作

1) 復蘇細(xi)(xi)胞(bao)：以(yi)下細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)凍存處(chu)理僅(jin)供參考，具(ju)體(ti)操作(zuo)步(bu)驟以(yi)隨貨產品說明書為主(zhu)。將(jiang)含(han)有1 mL細(xi)(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)的(de)凍存管(guan)在(zai) 37℃水(shui)浴中(zhong)(zhong)迅速搖晃解凍，加(jia)4 mL培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)混合均勻(yun)。在(zai)1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液(ye)，加(jia)1-2 mL培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)后吹勻(yun)。然后將(jiang)所有細(xi)(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)加(jia)入含(han)適量培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)的(de)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)瓶中(zhong)(zhong)培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)過夜(ye)(ye)（或將(jiang)細(xi)(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)加(jia)入10 cm皿中(zhong)(zhong)，加(jia)入約(yue)8 mL培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)基(ji)，培(pei)(pei)(pei)(pei)養(yang)過夜(ye)(ye)）。第二天換(huan)液(ye)并檢查細(xi)(xi)胞(bao)密度。

2) 細胞(bao)傳代(dai)：如果(guo)細胞(bao)密度達(da) 80%-90%，即可進行傳代(dai)培養。

    a、棄去培(pei)養上清，用不含鈣、鎂離子(zi)的PBS潤(run)洗細胞(bao)1-2次。        

    b、加1 mL消化(hua)(hua)液(ye)(ye)（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于(yu)培(pei)(pei)(pei)養瓶中，使消化(hua)(hua)液(ye)(ye)浸潤所有(you)細(xi)胞，將(jiang)培(pei)(pei)(pei)養瓶置于(yu)37℃培(pei)(pei)(pei)養箱中消化(hua)(hua)1-2 min（視細(xi)胞情況而定），然后(hou)在顯微鏡下觀察細(xi)胞消化(hua)(hua)情況，若(ruo)細(xi)胞大部分變圓并脫落，迅速拿(na)回操(cao)作(zuo)臺(tai)，輕(qing)敲幾下培(pei)(pei)(pei)養瓶后(hou)加2-3ml培(pei)(pei)(pei)養基終止消化(hua)(hua)。輕(qing)輕(qing)打(da)勻后(hou)裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄(qi)去上清液(ye)(ye)，補加1-2 mL培(pei)(pei)(pei)養液(ye)(ye)后(hou)吹(chui)勻。        

     c、將細(xi)胞(bao)(bao)懸液按1:2比例分到新(xin)的(de)含8 mL培(pei)養基的(de)新(xin)皿中(zhong)或者瓶中(zhong)，置于培(pei)養箱(xiang)中(zhong)培(pei)養。 3) 細(xi)胞(bao)(bao)凍存(cun)：待細(xi)胞(bao)(bao)生長(chang)狀(zhuang)態良好時，可進行細(xi)胞(bao)(bao)凍存(cun)。下(xia)面(mian) T25 瓶為例；a、收集細(xi)胞(bao)(bao)及細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養液，裝入(ru)無菌離(li)心管中(zhong)，1000 rpm條件(jian)下(xia)離(li)心4 min，棄(qi)去上清(qing)液，用PBS清(qing)洗一遍(bian)，棄(qi)盡PBS，進行細(xi)胞(bao)(bao)計數。

     b、根據細胞(bao)數量(liang)加入無(wu)血清細胞(bao)凍存(cun)(cun)液，使細胞(bao)密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存(cun)(cun)管凍存(cun)(cun)1mL細胞(bao)懸液，注意(yi)凍存(cun)(cun)管做好標識。將凍存(cun)(cun)管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuan)入液氮灌儲存(cun)(cun)。記錄凍存(cun)(cun)管位置以(yi)便(bian)下次拿取。  

三、培養注意事項

1. 收到細胞后(hou)首先觀察(cha)細胞瓶(ping)是否(fou)完好，培養液是否(fou)有(you)漏(lou)液、渾濁等現(xian)象，若有(you)上(shang)述現(xian)象 發生請及時和(he)我(wo)們聯系。

2. 仔(zi)細(xi)閱讀(du)細(xi)胞說明書，了(le)解細(xi)胞相(xiang)關信息，如(ru)細(xi)胞形(xing)態、所用(yong)培養基、血清比例、所需 細(xi)胞因子(zi)等，確保細(xi)胞培養條件一致(zhi)，若由于培養條件不一致(zhi)而導致(zhi)細(xi)胞出現問題，責任由 客戶自行承擔。

3. 用 75%酒精擦拭細胞瓶(ping)表面，顯微鏡下(xia)觀(guan)察細胞狀態(tai)。因(yin)運輸(shu)問題，部分(fen)細胞由于溫(wen)度 變化(hua)及劇烈碰(peng)亡破碎形成碎片，是正(zheng)常現象。觀(guan)察好(hao)細胞狀態(tai)后，75%酒精消毒瓶(ping)壁將(jiang) T25 瓶(ping)置(zhi)于 37℃培養箱放置(zhi) 2-4h。

4. 貼壁細胞(bao)可以消化(hua)，懸浮細胞(bao)直接(jie)混勻收集細胞(bao)，900 rpm-1000 rpm 離心 3 min，棄上 清。加(jia) 5 mL PBS 重懸細胞(bao)，再 900 rpm-1000 rpm 離心 3 min，用(yong)新鮮的培養(yang)(yang)基重懸 細胞(bao)，并接(jie)種到新的培養(yang)(yang)瓶或培養(yang)(yang)皿中，置于培養(yang)(yang)箱中進行培養(yang)(yang)。

5. 請客戶用(yong)相同條件(jian)的(de)培(pei)養(yang)基用(yong)于(yu)細胞培(pei)養(yang)。

6. 建議客戶(hu)收到細(xi)胞(bao)后前 3 天各拍幾張細(xi)胞(bao)照片，記錄(lu)細(xi)胞(bao)狀態，便(bian)(bian)于(yu)和我(wo)(wo)司(si)技術(shu)部溝(gou)通 交(jiao)流。由于(yu)運輸的(de)(de)原(yuan)因，個別敏感細(xi)胞(bao)會(hui)出現不穩定的(de)(de)情(qing)況(kuang)(kuang)，請(qing)及(ji)時和我(wo)(wo)們聯系(xi)，告知細(xi)胞(bao) 的(de)(de)具(ju)體情(qing)況(kuang)(kuang)，以便(bian)(bian)我(wo)(wo)們的(de)(de)技術(shu)人(ren)員跟蹤(zong)回(hui)訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用(yong)的培(pei)(pei)(pei)養(yang)基 (灌液培(pei)(pei)(pei)養(yang)基) 不(bu)能再用(yong)來培(pei)(pei)(pei)養(yang)細(xi)(xi)胞(bao)，請換(huan)用(yong)按照說明書細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei) 養(yang)條件新(xin)配制的培(pei)(pei)(pei)養(yang)基來培(pei)(pei)(pei)養(yang)細(xi)(xi)胞(bao)。     收到細(xi)(xi)胞(bao)后第一次(ci)傳(chuan)代建議 1：2 傳(chuan)代。

9. 注意(yi)：  1:2 傳(chuan)代就是(shi) 1 個(ge) T25 瓶傳(chuan) 2 個(ge) T25 瓶或(huo)者 2 個(ge) 6cm 皿。不是(shi) 1 個(ge) T25 瓶傳(chuan) 2 個(ge)10cm 皿。

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