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PK-1細胞

二、細胞(bao)培養操作

1) 復蘇(su)細胞：以(yi)下細胞培養(yang)(yang)凍存處理(li)僅(jin)供參考，具體操(cao)作步驟以(yi)隨貨產品說明書為主。將(jiang)含(han)有1 mL細胞懸(xuan)液的凍存管在 37℃水(shui)浴中(zhong)迅速搖晃(huang)解凍，加(jia)(jia)4 mL培養(yang)(yang)基混合均勻。在1000 rpm條件(jian)下離(li)心3 min，棄去上清液，加(jia)(jia)1-2 mL培養(yang)(yang)基后(hou)吹勻。然后(hou)將(jiang)所有細胞懸(xuan)液加(jia)(jia)入含(han)適量培養(yang)(yang)基的培養(yang)(yang)瓶(ping)中(zhong)培養(yang)(yang)過(guo)夜(ye)(ye)（或將(jiang)細胞懸(xuan)液加(jia)(jia)入10 cm皿中(zhong)，加(jia)(jia)入約(yue)8 mL培養(yang)(yang)基，培養(yang)(yang)過(guo)夜(ye)(ye)）。第二天換液并檢(jian)查細胞密度(du)。

2) 細胞傳代(dai)：如(ru)果細胞密度達 80%-90%，即可進行(xing)傳代(dai)培養。

    a、棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子(zi)的PBS潤洗細胞1-2次。        

    b、加(jia)1 mL消化(hua)液(ye)(ye)（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，使消化(hua)液(ye)(ye)浸(jin)潤(run)所有細(xi)胞，將培養瓶置于37℃培養箱中消化(hua)1-2 min（視細(xi)胞情(qing)況而定），然后在顯微(wei)(wei)鏡下(xia)觀察細(xi)胞消化(hua)情(qing)況，若(ruo)細(xi)胞大(da)部分變圓并脫(tuo)落(luo)，迅速拿(na)回操(cao)作臺，輕敲幾(ji)下(xia)培養瓶后加(jia)2-3ml培養基終止消化(hua)。輕輕打勻后裝入無(wu)菌離(li)心管(guan)中，1000 rpm離(li)心5 min，棄去上清液(ye)(ye)，補加(jia)1-2 mL培養液(ye)(ye)后吹(chui)勻。        

     c、將(jiang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)懸液(ye)按1:2比例(li)分到(dao)新(xin)的含(han)8 mL培(pei)養(yang)(yang)基的新(xin)皿中(zhong)或(huo)者瓶中(zhong)，置于培(pei)養(yang)(yang)箱(xiang)中(zhong)培(pei)養(yang)(yang)。 3) 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)凍(dong)(dong)存：待細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)生長狀態良好(hao)時，可進行(xing)(xing)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)凍(dong)(dong)存。下面 T25 瓶為例(li)；a、收集細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)及細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養(yang)(yang)液(ye)，裝入無菌離心(xin)(xin)管(guan)中(zhong)，1000 rpm條件下離心(xin)(xin)4 min，棄(qi)去(qu)上(shang)清液(ye)，用PBS清洗一遍，棄(qi)盡PBS，進行(xing)(xing)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)計數。

     b、根(gen)據細胞(bao)(bao)數量加(jia)入(ru)無血清細胞(bao)(bao)凍存(cun)(cun)液，使細胞(bao)(bao)密度(du)5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存(cun)(cun)管凍存(cun)(cun)1mL細胞(bao)(bao)懸液，注意凍存(cun)(cun)管做好標識。將凍存(cun)(cun)管放(fang)入(ru)-80℃冰箱，24 h后轉入(ru)液氮(dan)灌儲存(cun)(cun)。記錄凍存(cun)(cun)管位置以便下次拿取。  

三、培養注意(yi)事(shi)項

1. 收到細(xi)胞后首先觀察(cha)細(xi)胞瓶(ping)是否完好，培養液是否有(you)漏液、渾濁(zhuo)等(deng)現象，若有(you)上述現象 發(fa)生請(qing)及時和(he)我們聯系。

2. 仔細(xi)(xi)(xi)閱讀(du)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)說(shuo)明(ming)書(shu)，了解細(xi)(xi)(xi)胞(bao)相關信息，如(ru)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)形態(tai)、所用培(pei)(pei)(pei)養基、血(xue)清比(bi)例、所需 細(xi)(xi)(xi)胞(bao)因子等，確保細(xi)(xi)(xi)胞(bao)培(pei)(pei)(pei)養條件一致(zhi)(zhi)(zhi)，若由于(yu)培(pei)(pei)(pei)養條件不一致(zhi)(zhi)(zhi)而導致(zhi)(zhi)(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)出現問題(ti)，責任由 客戶(hu)自行承擔。

3. 用(yong) 75%酒精(jing)擦(ca)拭(shi)細胞瓶表面，顯微鏡(jing)下觀(guan)察細胞狀(zhuang)態。因運(yun)輸問(wen)題(ti)，部分細胞由(you)于溫度 變化(hua)及(ji)劇烈碰亡破碎(sui)形成(cheng)碎(sui)片，是正常現(xian)象。觀(guan)察好細胞狀(zhuang)態后，75%酒精(jing)消毒瓶壁將 T25 瓶置(zhi)于 37℃培養箱放置(zhi) 2-4h。

4. 貼壁細(xi)胞(bao)(bao)可(ke)以消化，懸浮細(xi)胞(bao)(bao)直接(jie)混(hun)勻收集細(xi)胞(bao)(bao)，900 rpm-1000 rpm 離心 3 min，棄上 清。加 5 mL PBS 重(zhong)懸細(xi)胞(bao)(bao)，再 900 rpm-1000 rpm 離心 3 min，用新鮮的培(pei)養基重(zhong)懸 細(xi)胞(bao)(bao)，并接(jie)種到新的培(pei)養瓶或培(pei)養皿(min)中，置于培(pei)養箱(xiang)中進行培(pei)養。

5. 請客戶用(yong)相同條件的(de)培養(yang)基用(yong)于細(xi)胞培養(yang)。

6. 建議客(ke)戶收到細胞(bao)(bao)后(hou)前 3 天(tian)各拍(pai)幾張細胞(bao)(bao)照片，記錄細胞(bao)(bao)狀(zhuang)態，便(bian)于和(he)我(wo)司(si)技術部溝通 交流。由(you)于運輸的(de)原因，個別敏感細胞(bao)(bao)會出現不穩定的(de)情況，請及(ji)時和(he)我(wo)們(men)(men)聯系，告知細胞(bao)(bao) 的(de)具體情況，以便(bian)我(wo)們(men)(men)的(de)技術人員(yuan)跟蹤(zong)回訪直至(zhi)問題解(jie)決。

7. 該細胞僅供(gong)科研使(shi)用。

8. 備注：運輸用的(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基 (灌液培(pei)(pei)養(yang)(yang)基) 不能再用來(lai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)細(xi)胞，請換(huan)用按照說明書細(xi)胞培(pei)(pei) 養(yang)(yang)條件新配制的(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)基來(lai)培(pei)(pei)養(yang)(yang)細(xi)胞。     收到細(xi)胞后第一次傳代建(jian)議(yi) 1：2 傳代。

9. 注意(yi)：  1:2 傳(chuan)代就是 1 個 T25 瓶傳(chuan) 2 個 T25 瓶或者(zhe) 2 個 6cm 皿。不是 1 個 T25 瓶傳(chuan) 2 個10cm 皿。

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